封面故事丨疫苗快跑 一場科學家的百日馬拉松

稿源:南方人物周刊 | 作者: 李宗陶 日期: 2020-05-02

“反正我們一刻也不敢松懈。這是一場馬拉松。”

本刊記者? 李宗陶? 編輯? 周建平 [email protected]

頭圖:清華大學張林琦教授實驗室內,張教授展示剛生產出來的還沒有純化的抗體?圖/本刊記者 梁辰

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閱讀本文前,請先接種以下“疫苗”】

Spike????? Spike Glycoprotein,刺突糖蛋白,位于新冠病毒外層,像一個個突起的皇冠。

RBD?????? Receptor Binding Domain,病毒刺突蛋白上的受體結合域。

ACE2???? 血管緊張素轉化酶2。新冠病毒主要通過刺突蛋白上的RBD跟人體細胞的受體血管緊張素轉化酶2結合,最終實現感染。

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這一次,微博和微信朋友圈里出現了冠狀病毒進化樹。

這不是科學家們第一次在流行病到來時對病毒進行基因分析。過去幾十年里,他們對艾滋病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒和SARS病毒都繪制過類似的基因演化樹,但除了科學界,很少有人關注。

2020年1月11日,王新泉在京郊開一個學術會。他是清華大學生命科學學院的教授,中科院生物物理所梁棟材和常文瑞院士的博士,美國斯坦福大學醫學院的博士后,眼下正帶著兩位博士、一位博士后,開展與人類疾病和健康相關的結構生物學研究。天色暗下來的時候,他習慣性地刷了下病毒學網站(virologic.org),一眼看到這些天他正等待的東西――

上海市公共衛生臨床中心&公共衛生學院與武漢中心醫院、華中科技大學、武漢疾控中心傳染病預防與控制研究所、中國疾控中心、澳大利亞悉尼大學合作,正在發布一例來自武漢的呼吸道疾病患者的冠狀病毒基因組(附序列)。該序列也已存入GenBank,并將盡快發布。

帖子頂端注明:“此帖由悉尼大學的愛德華·霍爾姆斯(Edward C. Holmes,進化生物學家)代表上海復旦大學張永振教授團隊發布。”發帖時間是美國東部時間1月10日。

張永振也是中國疾控中心傳染病預防控制所的研究員。在當代病毒學確定已知的5000種病毒里,他的實驗室利用宏基因組學建立的新體系,近五年來發現了2000種全新的病毒,其中一些發展出新的科或目,比如荊門病毒、楚病毒、秦病毒、魏病毒、燕病毒……荊門病毒還被收入普林斯頓大學編著的2015年版經典教材《病毒學原理》。

1月9日,張永振在武漢。下午,他出現在華中農業大學基因樓129會議室,為一百五十多位師生做了一場學術報告。結尾時他說:“跨種間傳播以及共進化,揭示了病毒傳播和進化的復雜性。因此,早發現、早識別、早解析、早預警,是我們對病毒由被動防御到主動防御的關鍵轉變。”

這天晚上,一個61歲的男人在當地醫院里停止了心跳。武漢市衛健委的專家在兩天后的11日向媒體介紹說,此人常年在武漢市華南海鮮市場采購,同時患有腹部腫瘤和慢性肝病。12日,武漢市衛健委在情況通報中首次將“不明原因的病毒性肺炎”更名為“新型冠狀病毒感染的肺炎”。

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“我立馬把序列下載了,發給博士生蘭君。我說你趕快去分析一下,看看是什么情況。”王新泉說,“聽說有可能是冠狀病毒的時候,我就已經有所準備。但沒有序列,沒法著手,我也不太好去問別人要序列,就等著。全世界都在等著。”

王新泉教授在實驗室 圖/本刊記者 梁辰

打開計算機,蘭君看見了這個有由19位作者(包括張永振)測定的序列。它包含29903個堿基,10個一組、60個一行排成長長的方陣――

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61 gttctctaaa cgaactttaa aatctgtgtg gctgtcactc ggctgcatgc ttagtgcact

……

在生物學軟件的幫助下,他開始比照冠狀病毒家族的這位不速之客與SARS的異同。電腦很快給出數據:79.5%的序列,一模一樣。

王新泉撥通了張林琦的電話。“我正打給你。”張說。

張林琦是清華大學醫學院的教授,主攻重大病毒性傳染病的致病機理、病毒與免疫系統的相互作用關系,同時研發抗病毒藥物、抗體和疫苗。28年前,拿到英國愛丁堡大學分子病毒學博士學位之后,他先后在美國兩所大學任教15年,是艾滋病雞尾酒療法發明者何大一團隊的主力華人科學家。

2003年,他和王新泉同時回國,落戶清華,率領各自的團隊在冠狀病毒領域合作了八年多,共同發表了多篇重要論文。和20年前相比,張林琦似乎沒什么變化,除了發際線又向后移了一厘米;而生于1973年的王新泉正頂著一頭茂盛的黑發進出實驗室。兩個團隊的實驗室同在醫學科學樓的二樓。

王新泉教授團隊成員合影:王新泉(前排居中)、蘭君、余錦芳、 田玉玲、葛紀彎(后排從左至右) 圖/本刊記者 梁辰

張林琦教授團隊成員合影:(從左至右)王瀚、李明茜、張林琦、方夢綺、梁清泰、單思思 圖/本刊記者 梁辰

三言兩語一勾兌,一周前他們的直覺被判為真:這個病毒不一般。

“大概在序列公布前幾天,專家群里就有說出‘冠狀病毒’的,這在當時確實是一個非常敏感的字眼。我記得非常清楚,有很多老師用的排除法:它肯定不是腺病毒,不是流感病毒……但不知道它是什么。我注意到民間也在用類似的辦法,列出了一些‘不是什么’。當時專家圈子里確實比較謹慎,因為一個新發流行病暴發之初,它的致病原和因果關系非常難確定。我們人身上有好多病毒,鎖定哪個是真正致病的,需要依據。”張林琦說,“要不要轉入研究,心里也有點猶豫,因為我們的工作量已經很大了,在手上艾滋研究的同時撿起一個新的項目,還是需要一定的勇氣和膽量。但序列一公布,我們馬上做了遺傳分析,確實跟SARS非常像,這事基本就定了,必須要全力投入。”

“哥倫比亞國立大學有位生物化學家說,我的整個學術生涯都在為這樣一個時刻做準備。你們有沒有這樣的感覺?”我問。

“說實話,那時候誰也不會想到疫情會發展到現在這個情況,對吧?”王新泉說。

“說實話,那時候誰都沒有想到病毒傳播能這么快,能從武漢迅速傳遍全國,然后遍布世界各個角落。”張林琦說。

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這對老搭檔決定立刻行動。

根據科學家們此前對SARS、MERS(中東呼吸綜合癥)這些由冠狀病毒引發的疾病研究經驗,冠狀病毒通常是用它表面刺突蛋白上的一小段RBD蛋白,跟宿主細胞的某一類特定受體(如SARS的受體是ACE2,MERS的受體是DPP4)結合,附著在宿主細胞表面。

我們已經知道,冠狀病毒的表面刺突蛋白(就那皇冠)是一個三聚體,是三個東西綁在一塊兒,每一個綁著的結構就有一個RBD,所以它有三個RBD在那待著,但它不老實待著,有點像北京小孩玩的那種三片葉子的風車——這RBD在風車上不老實,有時候站起來,有時候趴下,站起來、趴下;有時候一個站起來,有時候兩個站起來,有時候三個全站起來,是一個動態過程。

當然站起來和趴下跟它的生物功能直接有關。我們后來發現,RBD站起來之后,才能有效地跟細胞上的受體結合。有點像咱們的車鑰匙,你一摁,車門鎖蹦起來了。蹦起來之后,它就可以跟細胞受體結合,就可以把那細胞打開。

這種現象后來也被中外好幾個實驗室證明了,說明病毒表面蛋白構建了一個變化多端的場景,需要時不常地把鑰匙亮出來,一邊去找它的鎖,然后它就能進去,這個動態過程還是非常奇妙的。所以,當我們已經觀察到冠狀病毒表面蛋白有這種動態特點,在新型冠狀病毒出現以后,顯而易見,就是要確定它的RBD的結構特點是什么?這種結構特點,跟SARS和MERS有多大的相同性和相異性。病毒侵入人體細胞的瞬間是最重要的環節,我們的切入點就是從這兒開始的。

張林琦給我上了一堂三個小時的分子病毒學課。其中“我們后來發現”的“我們”,還包括清華醫學院向燁團隊、生命科學院王新泉團隊。從2017年開始,三個實驗室在多個頂級刊物上發表了SARS冠狀病毒刺突糖蛋白與其受體ACE2復合物的冷凍電鏡結構。

(注:3月19日,麻省理工學院在bioRxiv預印本上發布最新研究成果--RBD和ACE2結合位點是ACE2受體結合域上的一段α1螺旋式蛋白。這為多肽疫苗和藥物的研發提供了基礎。)

附著在宿主細胞表面的刺突糖蛋白-受體結合物,會被酸依賴的蛋白酶(如絲氨酸蛋白酶TMPRSS2等)兩次切割,目的是暴露出融合肽(fusion peptide);隨后,融合肽插入宿主細胞膜并與之融合,病毒的核酸分子得以在細胞內釋放,侵染就這樣完成了。

病毒入侵后,鳩占鵲巢,將健康細胞變成生兒育女的一間產房。這個細胞很快會釋放更多的病毒,隨后變成一具被病毒顆粒充滿的尸體。而人體,有大約40-60萬億個處在新陳代謝中的細胞。當尸體堆積到足夠多,疾病就降臨了。科學家們之所以從研究這些分子結構入手,為的是準確找到結合位點,設法(用藥物、抗體、疫苗等)阻斷病毒RBD與受體的結合。

1月15日晚9點半,清華醫學樓實驗室里燈光大亮,兩個團隊共十人召開緊急會議,他們剛在清華附近的近春園聚完餐(當事人憶起略有不安)。兩位帶頭人宣布投入新冠病毒研究,整體布局并分工,依據自愿原則,鼓勵博士們留守實驗室(大部分學生都買好了回家過年的車票,18號開始放寒假);立刻啟動新冠表面刺突蛋白基因序列的合成,然后表達RBD。

1月19日晚,單思思回到山西運城的家。她是2015級入學的直升博士,加入張林琦實驗室。第二天,她上了回北京的動車。列車開動,她哭了,母親的微信也到了:“以后回家機會多得是,現在國家需要你,好好干!”42天后,她做了一塊“此生最值得留念的ELISA板(一種用于酶聯免疫吸附劑測定的塑料點樣板)”。3月末,她第一次在實驗室里過了一個“生逢其時,重任在肩”的生日。

蘭君決定不回山西忻州過年,他給家里打電話。一年沒回家,過年還不回?十多天后,父母知道兒子在做什么。父親在微信里說,注意安全。母親發來的是:別太辛苦。從1月12日開始,每天早上7點多他進實驗室,晚上11點回寢室。除夕夜例外,他在春晚開播前收工,吃了頓餃子,“如果回家,也只吃餃子和包子。”幾天后,他把趙雷《成都》的歌詞改了――

讓我掉下眼淚的,不止想家的愁,

讓我依依不舍的,不止你的溫柔。

靈藥還要等多久,病患強忍難受,

讓我感到為難的,是求救的眼眸。

疫情一直在肆虐,研究停不下節奏,

深夜走廊的盡頭,有燈光在守候。

在那座苦難的城市里,有天使在努力,

病毒帶不走的,是希冀。

……

新冠病毒全基因在手,Spike全長約3800個堿基,其中RBD一段有六百多個堿基,蘭君要做的是:先下單由北京一家生物技術公司合成RBD的基因,通過重組表達的方式獲得RBD蛋白(主要是單思思的工作),然后在體外將RBD蛋白和人體細胞表面受體ACE2混合制備復合物,培養晶體,經過篩選和條件優化,獲得能夠進行X射線衍射的晶體。

“這中間每一步都得耗費時間和精力,每一步都不能出錯,不能耽誤時間。”蘭君說。

白天,只要打開純化蛋白的泵,實驗室里就有鼓點一樣的聲音陪伴他,催他。夜里,騎自行車回宿舍,路上人很少,車也很少,四面曠達,空氣清冽,車輪被路燈照成南瓜的形狀。一年前的這時候,他寫:行走在深冬的夜里,像一顆沒有防凍液的晶體。而此時,細胞上清液和蛋白純化充盈著他的身心,“很自豪,能做這些工作。”

不過大年初四,他忍不住又寫了幾句分行的——

想著母液有人配,瓶子有人洗的過去,

看著母液快見底,瓶子沒人理的今朝,

我此起彼伏。于是乎,我默默地拿起手機,

直到一句“這點屁事,自己搞定”出現在屏幕上,方才醍醐灌頂。

得,自己弄吧。

1月22日夜,單思思跟蘭君一起走在回寢室的路上,都快零點了。他們剛對純化出來的蛋白進行了跑膠驗證,發現正是他們想要的。“反正那天還挺高興的,我跟蘭君就在對,接下來怎么拿這個蛋白來做抗體的篩選,還有晶體培養。”兩小時后,武漢宣布封城。

單思思所在的課題組,一拿到基因公司合成的RBD片斷,迅速整理搭在兩種載體上。一種載體叫pcDNA3.1,注入哺乳動物細胞系,另一種叫Pfastbac,注入昆蟲細胞系,相當于在兩種類型的工具細胞里注入一小段DNA,表達生產出來的,就是新冠病毒的RBD蛋白。

她的年夜飯是在實驗室里吃的。師姐張綺的丈夫送來一大碗餃子,她開著電腦邊吃邊看春晚,身邊還有醫學院的一個師妹。武漢的場景在屏幕上展開,“越看越沉重,從沒跨過這樣的年。就盼著早點有突破,然后手里的實驗都得趕快,趕快去優化,趕快去證實。”

大年初一,深圳三院的三人小組進入負壓的P2 plus實驗室進行樣本檢測。從左至右 依次是:鞠斌、林靜燕、楊倩婷 圖/鞠斌提供

2200公里之外,深圳三院肝病研究所的鞠斌博士從臘月廿九開始,也一直在實驗室里工作。1月11日,這家深圳市的傳染病定點醫院收治了本市最初的兩例“不明原因的病毒性肺炎”病人。因為有臨床資源,肝病研究所在第一時間就得到了病人的血樣,后來建起了生物樣本庫。大年初一,鞠斌和另兩位同事穿戴好防護(從露眼頭罩、衣褲、鞋套到手套),三人一組進了負壓的P2 plus (介于P2和P3之間的安全等級)實驗室,開始第一次血液樣本檢測。

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張林琦把RBD蛋白比喻成鑰匙,管ACE2叫鎖。鑰匙開鎖,是新冠病毒侵入人體的關鍵一刻――

新型冠狀病毒表面RBD-ACE2復合物晶體結構,即鑰匙開鎖 圖/清華大學提供

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把鑰匙RBD生產出來之后,ACE2就是病毒要打開的鎖,這把鎖我們在做SARS的時候就有了,不需要重新做。下一步就是把RBD蛋白和ACE2蛋白混在一起,它倆相互作用,結合之后要叫它長晶體。那個晶體有點像家里鹽罐子邊上,在空氣潮濕的天里,長出來的那些個像針、像細毛的東西,實際上就是鹽晶分子在特定的溫度和濕度下,特別有規律的排列,可以想象成閱兵時的方陣。當X光照到這種特別規律排列的晶體上,它就會形成一種非常規律的衍射,有了衍射圖就可以通過計算機模型倒推蛋白的結構。

當時最大的突破點是,兩種蛋白在一定的反應條件下長出了晶體。這個條件包括鹽的濃度、離子的強度,還有一些所謂detergent,特定的化學物質。清華這邊結構生物學在施一公老師的帶領下,發展得非常快,有很大的優勢;我跟王老師過去八年的合作也使得這一步比較順利。

我們把同一種蛋白混合物點到幾百個反應條件下,放到一個4℃的環境里,讓它去長晶體。這個4℃的環境是一個大屋子,不是一個小冰箱,大屋子里擺滿了成百上千個不同的盤子,都是不同實驗室不同老師在做的晶體結構的研究。我們最期待的是什么呢?就是去檢查這些幾百個不同條件的時候,在那里邊能看到晶體長出來。這玩意兒要長得好的話,就跟女孩子訂婚戒指上的鉆石特像,長得不好的話,就有點像咱們鹽罐邊上長的那些細針。我們每天都去看,有沒有好的晶體長出來,像是在找好看的鉆石。

“第一次看到晶體長出來,是2月11號下午。一共試了960個條件,只有一個條件長出晶體。”蘭君說。一塊點樣板有96個池液格,他點了10塊板子,每一格池液就是一種條件。從前,為了晶體長出來,他向小豬佩奇祈禱過,也寫過《致我們終將見到的晶體》。這一回,佩奇終于神奇,大約兩周就將一幅掃帚狀的結晶圖案送到他的顯微鏡下。他立刻給導師王新泉發去照片,同時調整這一格里的池液條件。2月15日,第一粒漂亮的大“鉆石”出現了。

2月11日下午,蘭君在顯微鏡下看到最先長出來的蛋白晶體,長得像掃帚

優化條件后,2月15日長出的晶體,像鉆石

下一步是做X射線衍射。王新泉解釋說,研究SARS時,做的是刺突蛋白三聚體與受體的結構,長不出晶體,大小也適合做冷凍電鏡(清華就有);這次是刺突蛋白受體結合區RBD片段和ACE2的復合結構,適合做X射線衍射。

“X射線衍射(1912年由德國物理學家勞厄發現)在當年是一個比較牛掰的技術,跟它相關的一些發明創造都獲得了諾貝爾獎,當然現在已經非常常規了。”張林琦說,“做衍射的設備叫同步輻射光源,只有上海有。通常,我們是把晶體放進液氮罐,再通過特殊的包裝快遞出去。上海那邊收到之后,把晶體小心翼翼撈出來,放到極其高精尖的機器上,打上X光讓晶體產生衍射,然后在計算機里對衍射圖進行處理,解析結構,比如常見的α螺旋,才能拿到我們發在文章里的那些花花綠綠的照片。”

上海同步幅射光源,位于浦東張江高科技園區,是投資12億元的國家級重大科學工程和大科學裝置用戶平臺,建設了整整五年。它的核心區域,是產生各種同步輻射光的電子儲存環,一圈就相當于一個操場的400米環形跑道。

可是,各個人群的聚集單元都緊急、暫時地封閉了,部分交通管制了,快遞停了,人類像蝸牛一樣縮進各自的殼。王新泉說,“以前也有讓學生拎著液氮罐自己去上海的,可那會兒,學生去一趟回來,得隔離14天。”

晶體怎樣才能飛進上海?2月16日,王新泉急中生智,聯系了一位常為生命科學院的實驗室接人送物的司機,請他代為物色一位肯在特殊時期跑趟長途的司機。這年頭,人以群分,群里一吆喝,愿意跑活兒的魏師傅出現了。

蘭君挑了十多顆長得最標致的“鉆石”,小心翼翼撈出來,放在裝有冷凍液、也就是液氮的小罐里,交到魏師傅手上。魏師傅油門一踩,漏夜出發,第二天一早送到浦東。上海光源的周歡博士急忙到門口去接,拎了液氮罐直奔機房。魏師傅原路返回,22小時馬不停蹄。他得到了疫情期間一份特別的辛苦費,8000元。

從疫情被確認起,上海光源就開設了科研綠色通道,自1月12日至2月23日,安排了五次實驗機時,其中三次實驗結果――上海科技大學饒子和/楊海濤團隊、中科院微生物研究所齊建勛團隊、清華王新泉和張林琦團隊――促成了最早公開分享的新冠病毒關鍵蛋白結構,和兩篇分別發表在《細胞》雜志和《自然》雜志上的論文。清華團隊的晶體是2月17日上機的。

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“這大型機上的光源強度,比我們家用的光要強10的5次方到6次方倍。光源越強,晶體的衍射能力越強。我們送了十幾顆晶體過去,只有一顆晶體,而且是第一顆,收到了比較好的衍射數據,后面都不太行,所以非常幸運。我記得很清楚,2月17號周一晚上八九點鐘開始收數據,收到第一條衍射數據之后,我就知道這個結構可以解析了。我們立馬開始工作,可能花了兩三個小時,到12點的時候,結構就解出來了。我馬上跟林琦說了好消息,林琦就說,趕快連夜總結發表,別睡覺了。”王新泉道。

“結構怎么解呢?根據白霜衍射圖,首先要把電子密度圖做出來,完了用大的計算機系統去分析這個結構,需要挺長的上機時間,還要做一些優化、比較,等于一開始模模糊糊看云彩,最后撥開云霧看真相的過程。”張林琦的聲音里出現一種按捺不住的東西:“我一看,這結構太漂亮了!腦子里第一反應,這不哥倆么,跟SARS長得太像了,簡直一個模子刻出來的,一點都不夸張。這是個令人激動的時刻,感覺特別奇妙。”

“解完結構以后,立刻分工,學生去作圖做結構分析,我動手寫文章。我在家,他們都在實驗室,17號晚上熬了整整一夜。18號晚上本來也準備熬夜的,但是大家確實都干不動了,學生們可能一兩點回的寢室,我也休息了一下。19號接著做,文章連寫帶完善,用了整整兩天。20號凌晨,我們就把文章給投出去了。所以3月30號正式發表時,Nature上寫收到文章是2月19號。那會兒,全世界科學家都在賽跑。”王新泉說。

就在清華兩個團隊全力沖刺的同時,西湖大學周強團隊、中科院微生物所齊建勛團隊也成功解析出新冠病毒RBD與ACE2蛋白復合物的結構。公布成果時,三個團隊都附上了其他兩個團隊的工作進展介紹,也都將晶體結構公開,供同行下載參考。

“如果沒有一直上手在做這些實驗的研究小組,這幾步都需要好長時間的摸索、優化。我們不到一個月,結構就解出來了,而且是非常高的分辨率。從已經發表的文章來看,我們的結構分辨率目前是全世界幾家實驗室里最高的,2.45埃。一個埃是10的負10次方米,100億分之一米。分辨率越高,看得越清楚――病毒的RBD和它的受體是怎么咬合的,位點在哪兒,誰跟誰在一起就能把ACE2的蛋白撬動,或者使它有些結構上的變化,從而誘導它進入細胞。”張林琦忽然說,“你知道嗎,這一個月,相當于我們之前一年的工作量。基本上連軸轉,也沒覺著累。就是這事兒應該這么做,應該爭分奪秒。”

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1月25日0點40分,農歷新年的鐘聲剛在電視里敲響,深圳三院肝病研究所所長張政教授給張林琦發出一條拜年微信。讀博時,張政遇到了SARS,之后他在北京302醫院工作15年,期間因艾滋病研究認識了張林琦。年三十的傍晚他從實驗室出來,腦子里全是問號,最大的一個是,抗體研究怎樣去完成?他想到了清華張林琦。

張林琦正若有所思地刷著手機屏,這聲來自南方的問候提醒了他。病毒入侵機制正在研究中,早晚會解開,下一步要破這個機制,轉入抗體、疫苗的研究,就需要恢復期患者的血液樣本,而深圳三院是新冠肺炎患者定點收治單位,一定有。而張政團隊這邊,以鞠斌為主導的單克隆抗體研究小組正缺清華團隊擁有的東西。

“我們缺一些生物試劑,不是商品化的那種,是比如說根據某一段基因表達的病毒蛋白,這就需要清華團隊做的結構上非常不錯的RBD,相當于做一個釣餌。”鞠斌告訴我。兩位團隊領導互相拜年之后,他很快與張林琦團隊的張綺對接上,合作研發針對新冠的單克隆抗體。

鞠斌是中國疾控中心邵一鳴教授的博士和博士后,在艾滋病毒單克隆抗體領域有五六年的研究經驗。2018年底從北京到深圳,他也一直在從事這個領域的研究。經驗,加上實驗室里現成的一整套分離其他病毒單克隆抗體的儀器,構成了一個強有力的平臺――獨缺釣餌。

張綺2013年留德歸來,在張林琦實驗室做了四年博士后,隨后升任副研究員。春節前后,她正處在孕中期,妊娠反應雖不像之前那么強烈,但還是需要克服不少突如其來的不適,才能讓那些試管試劑離心機聽她的號令。和所有節后迅速回到實驗室的同行一樣,她也分不清今天是幾號、星期幾,更沒有周末的概念。

“每天來,能做還是盡量多做點,超過12點是正常的。那陣子管理特別嚴,每天進出醫學樓要登記,還有保安巡邏。有時候大半夜我正在實驗臺上,一回頭背后站一保安,等我簽字呢,怪嚇人的。”準爸爸理解、支持,并負責孕婦的愉快――有天晚上張綺11點到家,“呦,今兒挺早。”

1月25日,南北三個實驗室正式攜手合作。1月30日,深圳三院第一例康復病人出院。1月31日,清華新鮮出爐的蛋白試劑,立刻層層包裝發往深圳。

疫情暴發之初,一部2011年出品的美國電影《傳染病》被許多人重溫。它講了一個類似我們已經和正在經歷的新發病毒的故事。其中有個情節:美國疾控中心的一位女科學家做出了一個疫苗,她給自己注射以驗證安全性和有效性。注射完疫苗,她立刻摘下口罩,去病房貼近她已經被感染的父親。免疫學家、清華醫學院院長董晨教授在一堂公開課上講:整部電影在許多科學問題上是對的,但這個細節有點瑕疵。因為注射疫苗喚醒淋巴細胞的活化和功能,進而產生抗體,至少要在五天以后。他拜托聽眾若有機會見到導演,告知一聲。

張政教授

“從我們臨床收集的數據看,IgM(陽性一般提示正在感染)產生快一點,大概2-3周;IgG(陽性一般提示既往感染)慢一點,一般4-5周。”張政說的,是這次深圳三院收治新冠病人體內產生抗體的大致時間。

聽張林琦講單克隆抗體的原理――

我們體內對付外來異質最重要的生物防衛武器之一,就是B細胞產生的抗體,當然還包括一些T細胞的功能。像我們小時候打的十四五種疫苗,都是誘導體內產生針對這些疫苗的抗體,抗體生成之后,會產生記憶,保證一輩子不會被這些病原體困擾。但是一個疫苗打完之后,我們身體里產生了好多抗體,抗體和抗體之間是有很大差別的。如果把抗體比喻成子彈,它打(結合)病毒不同的位置,產生的后果是截然不同的。如果抗體結合到病毒的胳膊和腿,對于病毒的殺傷力肯定不如結合到病毒的心臟來得有效。所以抗體的靶向性,以及它和病毒的結合能力,決定了抗體對病毒的抑制能力。所以我們的目標是把這些能夠結合病毒心臟部位的、具有殺傷力的抗體分離出來,鑒定它,然后應用好,這是整個感染和免疫界最大的研究重點和難點。

怎么做呢?因為我們血漿里存在的那些抗體實際上是個混合體,它非常復雜,沒法做。但是,產生這些抗體的B淋巴細胞是可以一個一個分開的。單個看,每一個B細胞產生一種抗體,每個抗體的靶向和結合能力都是不同的,是B細胞內不同抗體的遺傳密碼決定的。假設你體內有100個B細胞,有一個B細胞能產生直擊新冠病毒心臟的抗體,那么這個B細胞就專門生產這一種抗體,它是單一的、單純的,所以叫單克隆抗體;而血漿中抗體的混合體,叫多克隆抗體。

所以,為了獲得直擊新冠病毒心臟的抗體,我們必須抓到抗體的源頭,就是這類抗體存在于B細胞里的編碼基因。獲得這些基因后,我們可以通過體外合成的方法,生產100個B細胞的抗體,經過純化和定量后,跟新冠病毒混合在一起,評估它們抗病毒的能力。這樣,就能在這100個里頭,挑出真正可以直接殺傷病毒心臟的最優秀抗體。分離、鑒定這些單克隆抗體,為我們研發治療和預防新冠病毒最有效的醫學干預手段(比如藥物),奠定了堅實的基礎。

鞠斌有個還差三個月就三歲的女兒,叫花生。花生總想著出門,因為惦記小區附近的搖搖車,她剛學會往它們肚子里塞硬幣。媽媽告訴她:“爸爸是科學家,等爸爸打敗了病毒,咱們就可以去坐搖搖車了。”為了支持爸爸打敗病毒,媽媽辭去了工作,全心照顧家庭和花生。

科研剛啟動時,鞠斌也是一個人在實驗室,過著一種精微的細胞時間――再過兩天細胞該收了;測序結果后天該回來了……他打算以后慢慢告訴女兒,這個庚子年的春天,他整天泡在實驗室里做了什么——

我們做的是一種單克隆抗體,類似于采用基因工程的手段,從病人的血細胞(不是血清也不是血漿)里把淋巴細胞分離出來,對它進行染色。淋巴細胞里有能夠產生抗體的B細胞,但是B細胞有很多,能夠產生新冠病毒抗體的很少,所以我們第一步的工作就是,怎么從B細胞的海洋里找到能夠編碼抗擊新冠病毒的那些抗體。

這就需要用到清華團隊做的RBD釣餌。我們用流式分選儀,在B細胞的海洋里,把能夠和RBD蛋白結合的特異性B細胞,一個一個地釣出來,這就是單細胞分離。釣出來的單細胞放進一個一個的小孔里,開始裂解,裂解完得到的RNA逆轉錄成cDNA,然后進行巢式PCR(注:一種DNA擴增技術,PCR儀長得像個電飯煲),用抗體特異性的引物去擴增DNA,擴增時就會有陽性條帶顯示。

陽性的條帶出來之后,這部分的抗體產物就可以送去測序。但有了序列,你還是不知道它的功能怎么樣。所以說要構建一些表達載體或者表達片段,就是說把這一段抗體基因放到含有啟動子(DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結合并起始RNA合成的序列,它是基因表達不可缺少的重要調控序列。沒有啟動子,基因就不能轉錄)這類表達元件的真核載體或片段上,抗體基因就能夠進行表達。把這個表達產物轉染/導入工具細胞之后,工具細胞就能夠分泌抗體了,大約2-3天之后,這個細胞培養液的上清里就會有抗體產生——相當于我們在體外重現了抗體的分泌過程。然后把上清液收集下來,去檢測它能不能識別RBD的蛋白——用?elisa的方法就把能識別RBD蛋白的結合抗體、甚至是能夠強力阻斷病毒去感染細胞的中和抗體給挑出來。這個工作量是非常大的。我們實際做了將近700個抗體,最后有206個是陽性。

單克隆抗體的優勢在于,它產生的所有抗體是百分百一樣(想象復印機),特性、功能也都一模一樣。第二點就是,抗體的濃度可以做得足夠高,因為體外生產,質控和產量都非常有保證。

這206株抗新冠病毒的單克隆抗體,是從八位康復者血液的B淋巴細胞中分離出來的。張綺在清華的P2實驗室里,通過假病毒系統檢測到,206個抗體的確能結合病毒(把它給鉗住了),從而阻止病毒入侵細胞。像蘭君一樣,她也要做出結合物的晶體結構,想看清到底是哪些關鍵的位點在發揮作用。最后他們發現,其中有兩株抗體表現出強大的抗新冠病毒能力,可以將RBD與ACE2的結合降低99.2%和98.5%。3月21日,這項研究成果發表在未經同行評審的預印本平臺bioRxiv上,第一作者為鞠斌和張綺。

深圳三院抗體研究團隊。從左至右依次是:鞠斌(助理研究員)、葛向陽(實驗技術員)、宋碩(在站博士后)、余嘉臻(實驗技術員)、周兵(在站博士后)、劉小菊(在讀博士生)

團隊的目標是篩選、優化出最有效能的幾株,往藥物上發展。張政介紹,已做了假病毒中和,真病毒中和也重復了幾次,然后往大動物身上推。“過程比較復雜,涉及恒河猴實驗的資質和資源,現在我們正在排隊、協調,進展比較緩慢。”

單克隆抗體對患者有效,那么,對尚未感染的人群有效嗎?

“會有作用。比如說對一些高風險人群,我們可以用抗體給予預防。但它的防護是短期的,長期還是要靠疫苗。”張政說。

他同時透露了一個消息:分離出來的幾株高效抗新冠病毒抗體,在清華大學和一家由傳染病領域權威任CEO的醫藥公司推動下,正進入生產和臨床應用的開發。“期待在國際上率先研發成功抗新冠病毒的抗體藥物。”他說。

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“這差不多一百天的研究有沒走過彎路?或者說,有什么浪費了你們的時間?”我問張林琦。

清華大學張林琦教授實驗室內,張教授展示已經完成的ELISA板 圖/本刊記者 梁辰

彎路倒不至于。但是在科研路徑上我們曾經有一個假說或期待,后來被實驗結果推翻,這是有的。因為肉眼看到了新冠跟SARS在結構上那么相近,我們就特別期待它們在免疫系統識別上也相近。但是,我們用新冠感染者的血清去識別這哥倆的RBD,識別哥哥的,不識別弟弟。我們又用以前其他小組的老師們分離出的一些SARS的單克隆抗體,按照剛才說的血清實驗的方法去做交叉反應,結果一樣:互不識別。也就是說,我們眼睛看到的結構相似性,在免疫系統面前根本就是nothing。

現在我們分析,雖然它倆框架確實是很接近,但是它們的組分、氨基酸還是有差別的,而這些差別是關鍵性的。在免疫系統面前,病毒表現出的是綜合素質,外形結構可能還是個粗線條。我們常說細節決定成敗,免疫反應識別一定是細節到單個分子、單個原子,所以免疫反應才是真正判定這哥倆是不是孿生兄弟的最權威的專家,而不是我們人的眼睛。

新冠病毒SARS-CoV-2是單鏈正義RNA病毒,被歸入冠狀病毒科β屬,與來自蝙蝠的兩種冠狀病毒TG13和ZC45有較高的基因組序列同源性。導致非典的SARS-CoV和導致中東呼吸綜合癥的MERS-CoV也屬于β屬冠狀病毒,這些病毒在不到20年的時間已經釀成了三次重大的人類傳染病,說明β屬冠狀病毒是一個高致病性病毒分支。

張林琦研究了三十多年艾滋病毒HIV,十多年SARS和MERS病毒。當我把民間流傳的陰謀論、人造說、新冠變異快導致一個人可能染上兩種病毒等等說法一股腦擺在他面前,他用科學精神和這些知識、經驗來解答――

從自然界的進化來看,各種生物的基因序列都是在持續發生變化的。但不同物種之間,變化速率有很大的差別;而病毒之間,變異也有很大差別,這完全取決于病毒復制機器的準確性。病毒天生就是這么一個機器,它在不斷地復制自己,說得更科學一點,它的聚合酶能按照它原來的模板復制自己的子孫萬代和遺傳信息。

不同物種、不同病毒的聚合酶在復制過程中的準確率是固定的。就像有些小孩子從小就不注意細節,容易犯錯誤;有些小孩子天生就特別守規矩,比較認真,這是他的天性。病毒也是這樣。比方說艾滋病毒,大家都知道它變異很快。為什么變異快?是因為它管復制的酶在合成它自己的時候出錯率高,比方說它每合成1000個核苷酸就會出現一個錯誤,或者每1萬個里它就會出一個錯,這是它控制不了的,它就是這個本性。新冠的復制準確率肯定要比艾滋病毒高,高多了,可能是每50萬個里出錯一次,它本性就是比較穩定。而我們人體的基因復制準確率可能是100萬或者1000萬個里頭出一個錯誤。目前我們已經看到的是,新冠病毒變異程度要比艾滋病毒小多了。

重造病毒,或者說通過基因突變賦予某種功能,在實驗室是可以實現的。但是要做一個能入侵人體的活病毒,而且這個活病毒又能在體外生長傳播,是非常非常困難的。人造的病毒在生存和傳播方面,永遠不及自然選擇出來的具有優勢。因為自然選擇的條件要復雜嚴酷得多,天長日久,病毒得經歷多少磕磕碰碰,過五關斬六將,或者達成妥協,才能在這個世界上存活,占有一席之地。

新冠的研究正在做,還不好說,但在幾十年艾滋病毒的研究里,科學家們做出一個基因上動過手腳的病毒打到機體里后,但凡加了、減了一個什么,它一會兒就把這東西全給補回來了,回到了它原來的狀態,這是艾滋病毒極其突出的一個現象。比如說,你在研究中發現,艾滋病毒胳膊這塊是致病的壞東西,那你在體外把它胳膊給砍了,就是把那段基因給它砍了,完了你把病毒在體外培養或者放到動物身上,過一段發現什么呢?它那胳膊又長回來了,它就這么厲害!說明什么呢?說明這個病毒進化到現在,它一定是經過好長好長時間的優化,如果那段基因對它來說是必要的、缺不了的,它一定會給你補回來。

所以,真正要做成一種像自然病毒一樣強悍的、像新冠病毒這么廣泛傳播的,我覺得是有很大難度的,再干脆點說,我覺得不大可能。這有點過高估計了我們人的能力,人就算有這個心,也沒這個本事。生物它再低等,它生存的智慧和能力遠遠超出人類那點想象,不然,這么小的病毒怎么能把人類搞得這么被動?所以我們做病毒的這些人,到后來就對這些小東西產生了極大的敬畏感。它們太聰明了!人類離認識、了解這些病毒還有很遙遠的距離。

為什么新冠病毒傳播速度這么快?

新冠雖然不及艾滋變異快,或者說它有個傻傻的外貌,但是單從傳播效率來看,它超級有效,比SARS、MERS都厲害。很多科學家都對這一點產生了非常大的興趣,希望從分子水平解析,到底是哪個東西使得它有這種能力。

科學界有一些假設,這些假設跟新冠病毒表面蛋白成熟的過程,和它準備的過程有關系。最近有些在高水平雜志上發表的文章,都指向一個特點,就是新冠病毒在從被感染細胞里自我復制成功、分裂出來的那一刻,就已經進入了要感染下一個健康細胞的狀態,它那RBD,或者說鑰匙,嘣一下就拿手里了,就準備好要去開一個鎖。它的準備狀態極其高效,它著急,一旦進細胞它馬上進入感染狀態,馬上開始復制,這個過程是有一個酶在起作用。

相比之下,SARS和MERS要悠閑一些。它倆剛出生,先在世界上逛兩圈,然后再去想子孫萬代的事,真正碰到了要感染的細胞,才去找鑰匙,在時間和空間上,它們的準備狀態不一樣。這是細胞生物學已經發現的新冠和SARS、MERS極其不一樣的生化特點,當然還需要進一步研究證實。這個結構特點得益于它的遺傳編碼:新冠在刺突蛋白位點上多了4個氨基酸,這4個氨基酸特別容易被酶切掉,然后它就是一個立即準備著入侵新細胞的狀態。所以大家都認為這4個氨基酸是關鍵、致命、幫助病毒高效傳播的決定性因素。特別奇妙。

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“疫苗和抗體都是嚴謹的東西,不能搞大躍進,得按科學的規律去做。”單思思節后轉入了疫苗組,負責蛋白苗和多肽苗。張綺說:“數據得在那兒,我們心里才踏實。”

新冠研究伊始,張林琦在疫苗組布了4條線,另兩條線上是mRNA疫苗和腺病毒疫苗――

這兩支苗走得比較快。一個是核酸疫苗,跟美國西雅圖和國立衛生研究院已經上一期臨床那個很像;另一個是與天津醫科大學周東明教授合作的黑猩猩腺病毒載體疫苗。這倆各有千秋,mRNA走得更快一些。我們常規的疫苗,比如減毒活疫苗或滅活疫苗,都是利用不同形式的病毒蛋白,作為免疫原去免疫動物或人體。核酸疫苗的優勢在于,把核酸打到體內之后,人體細胞可以根據基因編碼生成蛋白,人體就變成一個生產病毒蛋白的工廠,其實是縮短了體外生產這個過程,所以它上人體的速度快。這個技術也是這兩年發展壯大起來的,但它能不能在體內誘導我們期待的有效反應,或者說保護反應,還需要進一步驗證。

臨床實驗是分段的,一期安全性實驗在健康人身上做,樣本量小,比如30-60個人;二期是進一步驗證安全性和免疫原性等,樣本量要擴大,通常300-400,也是健康人;三期是看有沒有真正的效用,那是要在高危人群或直接在疫區做,采樣量得好幾千甚至上萬人。

現在大多數疫苗研究團隊處在生產或者評估新冠候選疫苗安全性階段,也有幾個進入了臨床一期,最快的已經在籌劃二期,我覺得他們做得很好。國內也有不少團隊在做核酸疫苗的研究,速度比美國稍微慢一點,但從整體來說,都在一個發展階段。

我們實驗室里這兩個苗已經打到小鼠身上了,都看到了一些比較好的免疫反應或者抗體反應,還是挺令人鼓舞的。但是從現在實驗室階段到臨床之前,要經過大批量生產,然后質控,在動物身上評估它的安全性,然后才是到人身上開展一期臨床試驗。我們離臨床還有一段距離。

國際上,賽道已經鋪就。疫苗研究團隊的數字每天都在增長,人體試驗也在擴大。至4月14日,全球已有5株疫苗上了人體,中國3株,美國2株。其中,軍科院陳薇院士團隊的腺病毒疫苗是我國走得最快的,已于4月12日進入二期臨床;另兩株是滅活疫苗。

4月15日,武漢大學退休員工楊靜(左)和女兒車蒙娜(中),一起參加接種重組新冠病毒疫苗II期臨床試驗 圖/趙軍

“前段時間科技部和衛健委頒布的咱們國家疫苗的技術路徑,包括五大種,有滅活苗、有重組苗、有流感苗,還有其他一些不同的策略,大致上跟國外相似。這些疫苗及其策略的競賽,我其實特別不驚訝。因為疫情的態勢,疫苗需求量肯定會很大。每一種疫苗策略都有它的優勢和劣勢,有的比較快,有的比較傳統,但能保證工藝比較穩定、疫苗比較有效……”張林琦說,“反正我們一刻也不敢松懈。這是一場馬拉松。”

2003年SARS暴發時,鞠斌在老家山東威海念初三,正準備中考。他淺淺記得,到處宣傳要勤洗手勤通風。每天上午和下午,全校師生拿著椅子拿著書,去操場或別的地方上兩節課。這期間,學校對所有教室進行消毒。

清華園的操場上已經有人在踢球,戴著口罩。爬山虎在科學樓的紅磚墻上蔓開,綠得驚心動魄。桃花盛開,桃花樹下有座雕塑,是一對讀書的青年,前一陣被人戴上了口罩。春暖花開,口罩不見了。

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南方人物周刊 2020 第16期 總第634期
出版時間:2020年06月08日
 
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